二代测序手艺（nextgenerationsequencing，NGS）又称为下一代测序手艺和高通量测序，其可一次性对几百万到十亿条DNA分子停止并行测序，是一组较一代测序通量更高、成本更低、历时更短临时动化程度更高的测序手艺。因其可对一个物种的转录组和基因组停止深入、详尽、全貌的解析，因而又被称为深度测序。从年发端，采纳NGS探测诊断熏染性疾病发端逐步从国度实行室、疾控中央过渡来临床。最先行使的NGS平台为年发表的GS20测序仪，与过去基于Sanger测序旨趣的测序仪器比拟，其得到的微生物基因组数据量升高了百倍。以后以后，各家公司也别离推出了其各自的基于NGS的探测仪器。跟着NGS诊断神经熏染性疾病的研讨越来越多，从年过去每年颁发1-2篇研讨报导，先进到年的6篇、年的13篇，方今NGS曾经成为临床神经熏染性疾病诊断的有用东西之一。
01
神经熏染性疾病病原学诊断近况
神经熏染性疾病在临床上重要显现为脑炎和脑膜炎，也可显现为脑脓肿（硬膜外、硬膜下、脑本质）及脑肉芽肿等。神经熏染性疾病确诊的根据在于从脑本质或脑脊液内探测到病原生物的存在，而引发神经熏染的病原生物重要包罗病*、细菌、真菌、寄生虫、螺旋体、立克次氏体等。由于血脑樊篱的存在，在血清内难以探测到有用的病原体讯息，惟独在脑脊液以至脑本质内本领探测到，而脑脊液取材相对艰难、标本量小，均束缚了神经熏染性疾病病原体的检出。
近几年来，由于新病发原体熏染[重症急性呼吸归纳征（severeacuterespiratorysyndrome，SARS）病*、埃博拉病*、寨卡病*]的一直浮现，耐药细菌一直浮现，以及器官移植或免疫性疾病调节后各样前提致病菌的熏染，熏染性疾病再次回来临床医生的视线中。但熏染性疾病的病原品种繁密，保守的免疫学探测及病原微生物造就等办法，在判决熏染性疾病的病原方面耗时、吃力，难以准时地为临床供给靠得住的诊断根据，使不少熏染性疾病患者未能得到准时、有用的调节，致使其预后不良。
02
NGS在神经熏染性疾病诊断中的意义
年，加州大学CharlesY.Chiu团队在《新英格兰医学杂志》报导了天下第一例颠末NGS探测诊断的神经熏抱病例。一位屡屡头痛、发烧逼近1年的患者，在停止了38种不同的诊断实验（从血清学到造就和活检），仍旧没法明了其致病病原体，并投入了昏倒形态，而终究行使NGS探测明了其为钩端螺旋体熏染后，赐与针对性的青霉素调节，终究患者逢凶化吉。往后，多个高品质的个案报导和临床研讨曾经说明，NGS有潜力成为神经熏染性疾病的诊断东西。关于并非临床病院常例开展探测的囊虫、布氏杆菌、螺旋体等病原体，或许造就办法较繁杂或特别例开展的李斯特菌、奴卡菌等病原体，NGS探测能够回避常例查验的不够。
整体上，方今猜度有30%-60%的脑炎病例纵然颠末一切深入的查验，仍旧没法明了其病因。行使NGS探测可诊断病*性（DNA病*和RNA病*）脑炎。行使DNAse能够颠末下降人源化核酸的配景，从而显著升高病原微生物的检出率（30-50倍）。最关键的是，行使NGS探测时，能够在齐备没有先验讯息或许临床偏向性的时分探测到病原，是以可关于罕有、罕有熏染或许新发的熏染性病原体停止探测。
除了这些已知熏染人类的病原体除外，基于宏基因组的NGS探测，还可识别一些此前未知的能够引发人类疾病的病原体。如年，德国报导了3例基底节脑炎患者，颠末NGS在脑内探测到松鼠博尔纳病*，患者临床上以基底节病变成主，病发急骤，殒命率高，这是第一次发掘松鼠博尔纳病*熏染人类的凭证。年，日本Sakiyama等报导了4例显现为脑脊髓膜炎的渔民，常例查验包罗活检都未能明了其致病病原体，而颠末NGS探测发掘其是熏染了过去从不曾报导的属于古细菌域的嗜盐菌（Halobacterium），在赐与复方磺胺甲恶唑调节后患者齐备好转。上述报导均说明，NGS探测能够诊断出一些罕有的、新发的或许不榜样的病原微生物，如钩端螺旋体、星状病*、古细菌、博尔纳病*等，从而深入人们对神经熏染性疾病的领会。年，病院赵钢熏陶团队领衔获患了科技部“组学特点谱在脑膜炎病原学诊断中的运用”的庞大专项研讨成绩，拉开了国内NGS手艺在神经熏染畛域的行使。往后，病院关鸿志熏陶和华大基因毗连停止了中央神经熏染脑脊液NGS探测的系列研讨，曾经前后报导了疱疹病*、李斯特菌、布氏杆菌等关连病原体引发的中央神经系统熏染。年，病院熏染科张文宏熏陶团队，运用NGS手艺在1例眼内炎患者的玻璃体液中探测到伪狂犬病*（pseudorabiesvirus，PRV），初次阐明PRV能够熏染人类，并引发眼内炎。近来，由北京病院神经科关鸿志熏陶牵头的多中央脑炎配合组，行使NGS手艺活着界上初次报导了PRV致使人类脑炎的病例。我国在行使NGS诊断神经熏染的手艺先进上原形与天下同步。
03
脑脊液NGS病原诊断运用面对的题目
纵然脑脊液NGS探测给神经熏染的病原学查验带来了很大革新，但方今NGS的探测妥协读仍旧存在着许多题目。不同于NGS探测在遗传性疾病中的运用，熏染性疾病待测标本的成份繁杂、病原微生物核酸程度较低等成分均限制了脑脊液病原微生物的NGS探测。
敏捷度有待升高首先存在的题目是敏捷度，纵然NGS探测在诊断罕有、罕有病原体方面显现了优于保守办法的庞大气力，但关于罕有的结核分枝杆菌、隐球菌等病原体，其敏捷度并不强于保守办法。关于这些罕有病原体，反倒屡次是保守办法探测不到，NGS探测也查不到；而纵然保守办法探测到这些病原体，NGS仍旧大概探测不到或只探测到极小批奇异的片断，难以断定其精确性。
譬喻对结核分枝杆菌的宏基因组探测，方今最优的计划仍旧是在MGIT液体造就的原形上再停止NGS测序。究其因为，大概在于罕有病原体的致病力较强，仅需小批病原体便可致病，而对小批病原体的探测，NGS并不优于保守的造就和PCR探测。另一方面，结核分枝杆菌可所以胞内菌，而方今的探测办法主若是用脑脊液上清停止探测，就有大概遗漏胞内熏染的结核分枝杆菌；而结核分枝杆菌由于核酸中GC含量较量高（超高60%），大都细菌的解链办法不能充足将结核分枝杆菌的核酸链解开，是以在合适大都病原微生物的标本管教前提下，并不能有用地抵达探测结核分枝杆菌的成效。故对部份抗酸染色或GeneXpert探测后果阳性确诊的结核性脑膜炎患者，NGS仍旧只可在其脑脊液内探测到小批或底子没有探测到结核分枝杆菌的片断。方今对临床标本直接停止NGS探测来诊断结核分枝杆菌熏染难度很大，而做为代替，偶尔是将临床标本停止结核造就后再停止NGS探测，以此升高临床标本探测的阳性率。
除了病原体的载量和个性的成分外，关于一些存在机体免疫反响从而引发伤害的熏染性（后）脑炎，如乙型脑炎，重要倚赖血清学查验探测患者体内的乙型脑炎病*抗体来诊断，纵然最敏捷的RT-PCR探测也只可在10%患者脑脊液内检出其核酸片断，故关于这些患者，NGS探测的诊断意义有限，抗体探测大概是其更为有用的临床诊断办法。
是以，NGS纵然是高通量查验，并理论上能够探测险些一切病原微生物，但并不能齐备代替临床一切的病原体探测办法。这请求咱们一方面延续优化NGS的探测办法，使其能够尽大概多地遮盖病原体的界限和升高检出率，另一方面又要领会NGS手艺的控制性，从而在停止NGS探测的同时，要保存或探究其余有用的病原体探测办法做为增加或考证。
关于部份颅内脓肿或肉芽肿患者，由于其病灶控制于脑本质，释放到脑脊液中的病原体含量有限，是以关于这些疾病，惟独对机关标本停止NGS探测才大概测罹病原体。而脑机关与脑脊液在构成上不同很大，是以NGS探测的样本配景和构成城市影响到探测后果。但是由于脑机关取材艰难，方今对脑机关病原微生物的NGS探测探究还较量少。
脑脊液NGS病原体探测的诊断奇异度较低奇异度较差是限制NGS临床运用的另一个重要题目，在NGS汇报中屡次能够看到不致病病原体、不关连病原体、不明了病原体。与胃肠道、呼吸道不同，由于血脑樊篱的存在，曾经研讨者觉得脑内不存在微生物，是以唯有脑脊液内探测到细菌或病*即象征着神经系统熏染的存在，关于既往的染色、造就等手艺，这一绳尺均能创建。但跟着NGS手艺的浮现，在脑脊液内可探测到许多不同物种的片断。标本里屡次能够探测到多种没法注解的病原微生物的奇异读长，其部份因为大概在于标本、试剂的玷污，如处境微生物搀杂此中（如植物、植物病*等），难以识别。关于这些玷污，须要颠末实行室质控和标本间数据的比对停止消除。
是以，为了明了诊断，关于NGS探测到的病原体讯息偶尔须要行使保守办法停止考证，如关鸿志熏陶所诊断的PRV脑炎患者，均由华夏农业大学韩*研讨员团队对标本停止血清学探测予已确诊。针对他日繁杂的临床模范如血液、拭子、粪便等，数字PCR毗连NGS手艺能够升高探测方向序列的敏捷度，以扶助熏染性疾病诊断。
多个实行室的汇报也发掘，脑脊液NGS测序中存在着一些较为罕有的细菌成份，如丙酸痤疮杆菌、伯克霍尔德菌和不动杆菌等。健壮人或患者的脑机关和脑脊液内能否会存在一个雷同于低载量肠道菌群的微生物形成，值得探究。特为是近来研讨发掘，在非神经熏染性疾病如阿尔茨海默病或肌减弱侧索强硬患者的脑脊液和脑本质内，可探测到真菌、细菌或病*的核酸片断和奇异卵白成份，提醒病原微生物是神经变性病潜在的触发成分大概，但其临床意义方今尚未齐备明了，而其能否能成为终究的调节靶点尚有待探究。借助于NGS手艺，将大概从新领会病原微生物与神经系统的彼此影响形式和意义。
04
NGS探测在神经熏染性疾病中运用计谋
NGS手艺在熏染性疾病的诊断中具备极大的潜在代价，但也仍旧有很大的控制性。方今曾经报导的NGS襄理诊断神经熏染的研讨多为病例报导，大都景况下只可探测到思疑的病原微生物奇异读长，即高通量测序时，读出每一个片断的序列讯息，而做为临床诊断根据还不够明了的准则，往来去须要颠末典范病原学办法或临床调节成效对其停止评价。是以，在临床上行使NGS诊断神经熏染性疾病，须要在优化NGS查验办法的同时，延续完满NGS的考证妥协读。
NGS探测后果的解读——脑内义务病原体的判决和微生物菌群的意义解析NGS探测诊断中央神经熏染的重点是对义务病原体的识别。由于NGS探测偶尔能够得到大批配景或许无关微生物片断，从中探求或识别义务病原极其关键。方今罕用的办法包罗如下几种。
1.创立义务病原列表：对已报导的可致人类中央神经系统熏染的细菌、真菌、病*等微生物创立列表，一旦在NGS探测中浮现该致病病原体的片断，即认定为是致病病原体。这类办法关于致病性强或人类一些来往的病原体，如布氏杆菌、钩端螺旋体等病原体的诊断意义较大，而关于在机体中存在潜匿熏染的病*或许前提致病菌，由于不能辨别其为现症熏染仍是潜匿熏染，而须要稳重判定。
2.创立脑脊液罕有微生物数据库：关于各实行室、探测单元在NGS探测中罕有的配景微生物创立数据库，纪录其探测到的罕有片断数量。一旦在临床标本NGS探测中浮现不属于罕有配景菌界限的思疑病原体片断，或某种微生物的所检片断数量显然超出配景微生物数据库中的数据，则将其加入思疑的义务病原体，并进一步用其余办法停止考证。该计谋特为合适病*熏染引发的脑炎，如纯真疱疹病*熏染患者脑脊液内能够探测到绝对和相对数量都极高的纯真疱疹病*片断。
3.脑脊液微生物菌群的意义：肠道菌群对神经系统的影响方今已得到宽广认同，但脑内能否存在着一个雷同的微生物菌群，方今还存在争议。方今的测序后果在探测到思疑病原的同时，偶尔会探测到许多“不关连”微生物的片断，保守看法觉得其是系统玷污或实行室玷污致使，而不予