又到一年开学季，你的实验方案都设计好了吗？细胞转染实验用的工具病毒都选好了吗？各种病毒表达载体的区别与应用是否都清楚了呢？还不清楚的同学看这里，读完这篇文章解答你的疑惑，让你在科研路上少走弯路。
病毒表达系统简介
病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是目前最常用的基因导入方式之一，通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源目的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒，进而侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体内表达病毒的基因组可分为编码区和非编码区。其中，编码区包含病毒的必需基因和非必需基因，可分别表达产生病的结构蛋白和非结构蛋白;非编码区则含有病毒复制和包装所需的全部式作用元件。
由于野生型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使用的病毒恢复成野生型，必须对病毒载体进行一系列的遗传改造。如删除病毒基因组的非必需区，将顺式作用元件和反式作用元件分开连接至不同的载体上，或结合利用不同种病毒的必需蛋白等，最大程度地保证实验的安全性。哺乳动物病毒表达系统常常包含一到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因子的作用下，病毒复制、包装所需的顺式作用元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产生带有外源基因的病毒颗粒经浓缩和纯化后的病毒液即可用于侵染目标宿主细胞或动物体，实现外源目的基因在宿主体内的表达
病毒表达系统的优势病毒的转导效率比常规真核表达载体高很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达
常见工具病毒的介绍市面上常见的用于递送外源基因实现上调或者下调的工具病毒产品包括：慢病毒（LV）、腺病毒（Ad5）、腺相关病毒(AAV)，逆转录病毒（MMLV、MSCV）等。
在这里，我们主要介绍慢病毒（LV）、腺病毒（Ad5）、腺相关病毒(AAV)这3种比较常用到的工具病毒。
1、慢病毒表达系统（LV）
慢病毒表达系统是一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
因潜伏期、致病期长而得名“慢”，基于HIV病毒来源的慢病毒，其包膜修改为水泡性口炎病毒的VSVG，以拥有针对众多细胞感染能力的特性。其最大特点是感染细胞谱系广，能够整合，做出稳转株，长期稳定表达。
慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。野生型慢病毒基因组是线性双正链RNA。
慢病毒重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个长末端重复序列（LTR）之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。
当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。
2、腺病毒表达系统（Ad5）
腺病毒表达系统是一种很常用的哺乳动物病毒表达系统;但与慢病毒不同的是，腺病基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。
因从腺体中分离而得名，为流感病毒特性，拥有针对大部分细胞高感染的特性，但病毒于细胞存在时间较短（细胞为一周，动物2~3周），适合短时间的高量表达。
腺病毒重组载体构建完成后转染进入包装细胞。在包装过程中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，并以游离DNA的形式存在于细胞核中。
市面上常见的腺病毒载体都是通过改造优化过的，腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区，前两者与病毒包装相关（这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中）。因此，病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的（只能转导靶细胞而不能自我复制），大大提高了生物安全性。
3、腺相关病毒表达系统(AAV)
腺相关病毒（AAV）载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。不同于腺病毒，AAV的免疫原性极低，在体内几乎没有致病性，使得AAV成为许多动物研究的理想工具。
其复制需要腺病毒的帮助而得名，特点是病毒颗粒极小，适合在动物致密的组织扩散，而且单位体积滴度很高，因此被广泛用于动物实验。但其表达基因的时间较长，且表达水平较低，动物实验需要的周期也较长。
AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个反向重复序列（ITRs）之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。
当病毒转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一起进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。
人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织嗜性（即感染组织特异性）。当AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时，则会赋予病毒不同的血清型。
三种工具病毒表达系统的特点
该如何选择工具病毒
考虑点：感染情况、基因大小、实验周期。三者综合考虑，如：
1.细胞实验周期很长，那么只能考虑用慢病毒做为递质，以稳转株（稳定表达外源基因的细胞株）进行后续实验。
2.若基因太大，超出病毒的包装极限，那只能选择质粒。但质粒递送效率低怎么办？那就使用电转、纳米材料等非常规手段递送。
3.若质粒、慢病毒均无法有效递送，可以试试腺病毒的感染效率（在不考虑慢病毒整合引发的细胞变化，一般细胞实验优先推荐慢病毒，既能感染众多细胞，又能满足长期实验，腺病毒在需要短时间高效表达的情况下，或者其他方式无法递送的情况下才会选择）。
4.质粒、腺病毒属于游离的DNA特性，表达水平高且快；慢病毒由于基因组整合进入宿主细胞染色体，表达水平是要低于前者一个层级的，这点也要考虑在内，对于高表达需求的，尽量使用腺病毒。
常见问题一、细胞实验1、我要用慢病毒做实验，需要做哪些前期工作呢？
答：对于未接触过的细胞，或者新手，建议做预实验，或者通过公司、文献查阅病毒感染细胞的MOI值（指病毒感染细胞的比例，通俗讲就是有效感染单个细胞需要多少病毒）。
2、查询到MOI，是不是就不用做预实验了？
答：保险起见，还是建议做一下，有三个原因：第一，即便是同种细胞，但如果来源不一样，可能谱系上会有差异，导致实际最佳MOI有差异；第二，不同公司的病毒滴度标准有差异，有些以物理滴度标定，有些以活性滴度标定等；第三，很多细胞实验最终是要筛选稳转株的，因此需要摸索最佳抗性的浓度，这个浓度一般是查不到的。所以，为了避免耽误时间，在等目的病毒的时候，老老实实做预实验吧！
二、动物实验
考虑点：注射部位、基因大小、实验周期、成本。四者者综合考虑，如:
1.三种病毒，从滴度上排序：AAVADLV，滴度越高，等于单位体积内含有的病毒量越多，最终能感染的细胞数就越多，这就是AAV大量用于动物实验的原因。一般注射分为两种方式：A.系统性注射，如尾静脉、腹腔等，适合针对大型脏器或组织的递送（心、肝、血管、肌肉），三种病毒均可，但慢病毒的成本相对较高，在均可选择的情况下，尽量还是AAV。B.原位注射，如脑立体、肝门静脉等，这种方式大多需要对动物进行手术，缺点是实验操作要求高，动物容易死亡，但非常节省病毒（约为系统性注射的五分之一），因此，几种病毒都是可以的。2.常规推荐的AAV，由于总包装极限是4.7k（算上启动子、终止子、标记基因），能分配给基因的容量也就0~3k（要看具体启动子的大小）。若要特异性表达，而恰好对应的特异性启动子较大，超出包装极限，那么AAV就做不了，只能更换LV或者AD。当然，如果也超出后来者的极限，那就得尝试其他技术手段了。3.慢病毒属于整合型病毒，只要感染，不管细胞分裂与否，都能长期表达；AD不整合，在细胞存在一段时间（2~3周）则会丢失，如果用腺病毒，则需要在病毒注射之后的2周左右，再补注射病毒；AAV虽然也不整合，但其会伴随染色体长期存在，适合在非分裂的细胞长期表达（6个月），因此，实验周期的确认对应选择何种病毒。4.表达时间上，AD（1~2天）LV（3天）AAV（3~4周），因此，想要快速表达的，就选择前两个。如造模之后只能维持一周，需要外源基因快速表达，那就只能舍弃AAV了。以上就是小编收集整理的常见工具病毒的特性以及使用注意事项。你学会了吗？关于慢病毒（LV）、腺病毒（Ad5）、腺相关病毒(AAV)的结果特点以及包装原理的具体介绍可以参考本